關鍵新發明是將胜肽之一端連接在固相擔體上來進行合成反應。此固相支持物是一種不溶性的聚合物(樹脂),類似管柱層析實驗中所用的填充物。 胜肽就是在此固相擔體上以重複循環之標準反應組合將
親和性層析法(affinity chromatography)則利用蛋白質結合親和力之差異加以分離。 管柱中之膠體顆粒上共價聯結了特定化學分子基團 (配位基),會與這些配位基作專一性結合之蛋白質分子留在管柱上,因此延滯了它們通過管柱的速度,藉此達到分離純化的效果(圖3-18c)。 圖3-18(c) 顯示親和性層析法利用蛋白質與固定相 精氨酸基質上連接之特殊配位基間結合專一性能力之差異進行分離。會與固定相基質上交聯之特殊配位基作專一性結合之蛋白質分子會留在管柱上,不會結合的蛋白質則被緩衝液沖提出來。爾後再以含有游離配位基之緩衝液進行沖提,將結合在管柱上之蛋白質沖提出來,藉此達到純化的效果。 圖3-18(c) 蛋白質純化常用的三種管柱層析方法 最新改良的層析法是高效能液相層析法(high performance liquid chromatography;HPLC)。此方法利用高壓幫浦,搭配填充可抵抗高壓流動下造成 之碎裂力之高品質層析介質,以提高蛋白質分子在管柱中移動的速度。藉由層析時間的減少,HPLC 可有效限制蛋白質色帶的擴散分散現象,因而大幅提升解析度。 隨著每個純化步驟的完成,精氨酸蛋白質樣品含量與體積通常會隨之減少(表3-5),此時較適合以更複雜(且較昂貴)的管柱層析法加以分離。
Bruce Merrifield 的關鍵新發明是將胜肽之一端連接在固相擔體上來進行合成反應。此固相支持物是一種不溶性的聚合物(樹脂),類似管柱層析實驗中所用的填充物。 胜肽就是在此固相擔體上以重複循環之標準反應組合將胺基酸殘基一個接一個依序聯結而成(圖3-29)。 在每個連續性的步驟中,精氨酸上的保護基可避免無謂的副反應發生。
圖3-21 顯示利用蛋白質之等電點差異進行分離。 先添加適當兩性電解質以製備 pH 值穩定均勻之膠體,胺基酸待測蛋白質混合樣品則置入膠體中之樣品槽,通以電流後各種蛋白質則進入膠體並開始緩慢移動;當移動到與其 pI 值相同之 pH 值才停止。 圖 3-21 等電焦集法。 表 3-6 一些蛋白質之等電點 將等電焦集法與 SDS 電泳組合而成之實驗流程稱為二維電泳(two-dimensional electrophoresis)。 此方法用於分析複雜蛋白質混合物時可大幅提高其解析度(圖3-22)。
老年人,丌論男女,蛋白質食物攝取量都減少,且動物性蛋白質攝取比例也減少 蛋白質食物的紅綠燈 蛋白質食物的紅綠燈 豆類每份含蛋白質7兊、胺基酸脂肪5兊,75大卡 蛋白質食物的紅綠燈低脂肉類每份含蛋白質7兊、脂肪3兊以下,55大卡 蛋白質食物的紅綠燈 低脂肉類每份含蛋白質7兊、脂肪3兊以下,55大卡 蛋白質食物的紅綠燈 低脂肉類每份含蛋白質7兊、脂肪3兊以下,55大卡
它是利用蛋白質之大小、電荷、結合能力與其他性質之差異加以分離(圖3- 17)。 圖3-17 顯示標準的層析管柱元件包含底部的一個固相多孔狀墊片,材質大多為塑膠或玻璃。由固相基質組成固定相,提供移動相溶液流通其中。管柱底部之流出液會不斷被上方儲液槽中加入的緩衝溶液取代。待分離的蛋白質樣品混合溶液亦由上方置入管柱中,待其完全沒入固定相後再繼續補充緩衝液。 隨著蛋白質混合液在管柱中移動,精氨酸各種不同蛋白質會與固定相基質間產生程度不同的交互作用。 隨著蛋白質樣品往管柱底部移動,各種蛋白質色帶 (如圖蛋白質 A 為藍色、B 為紅色、C 為綠色)會逐漸加寬,進而達到分離之目的。
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